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　　激光共聚焦顯微鏡可以觀察到細(xì)胞內(nèi)已經(jīng)標(biāo)記好的蛋白質(zhì)和分子，為生物學(xué)研究提供了更直觀的觀測(cè)方法。如今，激光共聚焦成像已經(jīng)是一個(gè)非常常規(guī)的實(shí)驗(yàn)操作，廣泛應(yīng)用于生物學(xué)各個(gè)研究領(lǐng)域中。

　　在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，如果要進(jìn)行一次激光共聚焦成像，除了要知道相關(guān)的顯微鏡參數(shù)設(shè)置和操作以外，樣品的準(zhǔn)備也是非常重要的一個(gè)環(huán)節(jié)。

　　傳統(tǒng)方法

　　由于激光共聚焦實(shí)驗(yàn)對(duì)觀測(cè)耗材的底部有著比較高的要求，普通的培養(yǎng)皿，培養(yǎng)板或者培養(yǎng)瓶都不能直接用于激光共聚焦成像。

　　1.比較常用的是使用170μm左右厚度的蓋玻片作為激光共聚焦成像的細(xì)胞載體。但是使用蓋玻片，在實(shí)驗(yàn)操作上是非常麻煩的，如果買的是國產(chǎn)的蓋玻片，首先要做的一步是將蓋玻片清洗并且烘干滅菌，才能開始使用。

　　2.進(jìn)口的細(xì)胞爬片，雖然不需要清洗，但是還是需要進(jìn)行包被才能讓細(xì)胞正常貼壁生長。通常是將處理好爬片直接放在多孔板中，然后鋪細(xì)胞，熒光染色后，再用鑷子將爬片拿出，反過來放在滴有封片劑（甘油配置）的載玻片上，再進(jìn)行成像。如圖1所示：

　　圖1：使用蓋玻片和細(xì)胞爬片的做免疫熒光方法示意圖

　　操作流程：

　　1.蓋玻片需用濃硫酸浸泡過夜，第二天用自來水沖洗20遍，置于無水乙醇中6小時(shí)，后用三蒸水沖洗3遍，再放在飯盒或玻璃培養(yǎng)皿中烘干，消毒，再烘干后放入超凈臺(tái)備用。

　　2.準(zhǔn)備好的蓋玻片或者專業(yè)的細(xì)胞爬片需要根據(jù)細(xì)胞的貼壁情況使用多聚賴氨酸等蛋白包被。

　　3.培養(yǎng)板中放置爬片非常有技巧，要將爬片與培養(yǎng)板底部緊密貼合，這樣才能避免長成雙層細(xì)胞。

　　4.常規(guī)免疫熒光操作后，取出爬片。準(zhǔn)備載玻片一張，在中間滴加適量的封片劑（甘油配置），將蓋玻片或爬片翻過來，蓋在封片劑上，再用指甲油封片進(jìn)行成像。

　　5.在激光共聚焦成像之前，盡量用熒光顯微鏡檢查一下細(xì)胞狀態(tài)和成像效果，再去做激光共聚焦，畢竟做一次激光共聚焦的成像也不便宜的。

　　ibidi無需爬片的簡(jiǎn)便方法

　　這里要介紹ibidi的簡(jiǎn)便方法，大大簡(jiǎn)化了樣品準(zhǔn)備流程，需要用到專為共聚焦實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的共聚焦培養(yǎng)皿，這里以德國ibidi的共聚焦培養(yǎng)皿為例（ibidi 81156，ibiTreat底部處理）進(jìn)行說明。共聚焦培養(yǎng)皿的底部是polymer聚合物材質(zhì)，具有親水表面，讓大多數(shù)種類的細(xì)胞都可以直接貼壁，無需另外進(jìn)行包被；同時(shí)，它們的底部符合蓋玻片標(biāo)準(zhǔn)——厚度僅為180μm，在折射率，阿貝系數(shù)上，它們的性能和標(biāo)準(zhǔn)爬片一致，再加上極低的自發(fā)熒光和細(xì)胞可以直接貼壁的特性，使它們成為共聚焦成像的專用培養(yǎng)皿。

　　所有的操作都在培養(yǎng)皿中進(jìn)行，不再需要鑷子以及繁瑣的清洗，滅菌，包被程序（流程如圖2所示）

　　圖2：共聚焦專用培養(yǎng)皿的準(zhǔn)備樣品流程，可以直接進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)－染色－成像操作（圖中使用的產(chǎn)品為ibidi 81156共聚焦培養(yǎng)皿）

　　操作流程：

　　1.在超凈臺(tái)中打開無菌包裝的共聚焦專用培養(yǎng)皿，取出培養(yǎng)皿，加入細(xì)胞懸液，蓋上皿蓋，放入培養(yǎng)箱中靜置，等待細(xì)胞貼壁。常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)，待細(xì)胞長置合適密度再取出，進(jìn)行免疫熒光染色。

　　2.吸出培養(yǎng)基，以PBS清洗細(xì)胞，再用2%的多聚甲醛PBS溶液固定細(xì)胞。

　　3.20分鐘后，吸出固定液，加入0.1%Triton X-100

　　4.10分鐘后，吸出Triton，清洗細(xì)胞后加入BSA封閉。

　　5.加入抗體熒光染色后，吸出所有試劑，加入封片劑，可以開始共聚焦顯微成像。

　　使用共聚焦培養(yǎng)皿還有個(gè)好處：往往一個(gè)共聚焦掃描成像持續(xù)時(shí)間很長，培養(yǎng)皿中的液體非常容易揮發(fā)，共聚焦培養(yǎng)皿有皿蓋，可以減少揮發(fā)；如上述提到的ibidi共聚焦培養(yǎng)皿，有個(gè)巧妙的鎖扣設(shè)計(jì)，可以扣緊培養(yǎng)皿，確保在共聚焦成像的過程中，皿中的液體不會(huì)揮發(fā)(如圖3）。

　　圖3：ibidi共聚焦培養(yǎng)皿的鎖扣設(shè)計(jì)

　　ibidi共聚焦皿的方法優(yōu)勢(shì)

　　1.一個(gè)培養(yǎng)皿完成細(xì)胞培養(yǎng)－染色－成像等系列操作，無需包被，無需爬片，操作簡(jiǎn)便；

　　2.在培養(yǎng)皿里的操作對(duì)于操作技術(shù)的要求相對(duì)更低，也更便捷；

　　3.培養(yǎng)皿可使用皿蓋減少蒸發(fā)，杜絕揮發(fā)對(duì)成像的影響。

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