date:2022-08-23 14:17:50
1. 基本信息
下面的應用描述了小鼠巨噬細胞系RAW-264.7（生物安全等級2）在ibidi µ-Slides VI 0.4 和8孔腔室載玻片的培養方案。這是一個特殊的細胞系的例子，用于顯示粘附時間，細胞密度和細胞形態的示范。本應用可根據您的具體實驗要求進行調整。
2. 材料
在設置中應用下列材料：
·RAW-264.7 (murine macrophages, CLS - Cell Lines Service, Biosafety Level 2)
·Medium: RPMI 1640 with 2 mM L-Glutamin and 10% FBS
·µ-Slide VI 0.4, ibiTreat （ibidi 80606）
·µ-Slide 8 well, ibiTreat （ibidi 80826）
·Accutase (PAA Laboratories GmbH)
·1x Phosphate buffered saline (PBS)
3. 細胞培養與材料制備
在將細胞接種到玻片中之前，按照常規的方法培養細胞。
µ-Slide VI 0.4 ：通道玻片和培養基，在37℃和5%CO2培養箱中培養過夜。這對于避免隨著時間的推移出現氣泡至關重要。為此，在50 ml器中填充適量的培養基，并輕輕地將瓶蓋擰緊。在 µ-Slide 8孔載玻片開放孔井中，氣泡可排出到大氣中。
拆開µ-Slide的包裝，把它放在µ-Slide支架上，并在準備細胞懸浮液時同時將蓋子放在 Luer 適配器/孔上。
4. 播種細胞
分離細胞：
吸出培養瓶中的培養基，并用PBS洗滌細胞一次。每75cm² 燒瓶中加入3-5 ml的Accutase，并將燒瓶放入培養箱中以加快分離速度。如果是RAW-264.7細胞系，則大約需要8分鐘。使用Accutase分離的細胞存活率更高。
4.1. 將細胞接種到µ-Slide VI 0.4中
在µ-Slide VI 0.4建議的細胞濃度：最終細胞數 0.3 x 10 5 cells/cm²，制備濃度6 x 10 5cells/ml。通過將移液器尖端直接放在通道的入口上，將30 µl細胞懸浮液填充到每個通道中。將蓋子蓋在玻片上，在37°C和5％CO2下孵育半小時以固定細胞。
細胞貼壁后，分別用60 µl無細胞培養基填充儲液池。 避免將移液器吸頭直接指向通道的入口。將玻片放回培養箱中。
圖1：接種后一小時，在ibiTreat µ-Slide VI 0.4（貨號80606）中的RAW-264.7
圖2: 在ibiTreat µ-Slide VI 0.4中的RAW-264.7，孵育24小時后
圖3:在ibiTreat µ-Slide VI0.4中的RAW-264.7，培養四天后
4.2 將細胞播種在µ-Slide 8 well 中
在µ-Slide 8 well建議的細胞濃度：最終細胞數 0.3 x 10 5 cells/cm² ，制備濃度 1.1 x 10 5 cells/ml。將300 µl 的細胞懸浮液注入各孔中。將蓋子蓋在玻片上，在37°C和5% CO2中孵育。不需要進一步添加培養基。
圖4：在ibiTreat µ-Slide 8 well(貨號：80826)中的RAW-264.7，播種后1小時
圖5: 在ibiTreat µ-Slide 8 well中的RAW-264.7，孵育24小時后
圖6：在ibiTreat µ-Slide 8 well中的RAW-264.7，經過四天的培養
為獲得最佳的分布的勻的細胞，我們建議使用像µ-Slide VI 0.4 這樣的通道載玻片。在8孔腔室載玻片中，細胞密度可能會在孔的整個表面上因點而異，具體取決于細胞播種過程中的處理。
5. 免疫熒光染色
像往常一樣為您的細胞固定和染色。
注意：在 µ-Slides 中染色時注意液體的處理
µ-Slide VI 0.4 ：更換液體，先吸出兩個儲液池而不排空通道。 如果您使用的是真空設備，請注意不要將吸頭直接放在通道的入口上。 用100 µl新溶液沖洗通道3次。 從一側添加新的溶液，通過通道流入另一個儲液池，然后從另一側吸出，直到兩個儲液池都排空。注意通道永遠不要干涸！
µ-Slide 8孔載玻片：在 µ-Slide 8孔中，無需特殊處理措施。像在任何其他培養皿或孔板中一樣的交換液體。
下文中，給出了使用以下材料對細胞核和肌動蛋白絲進行染色的示例：
細胞核：DAPI（Diamidino pheylindol dihydrochlorid） SIGMA, 32670
肌動蛋白絲：Phalloidin, Alexa Fluor ® 488 Conjugate, LONZA, PA-3010
1. 用3.7% 的PFA在PBS（pH 7.4）中室溫下固定細胞10分鐘。
2. 用PBS清洗細胞三次。
3. 用Triton X 100（0.1%）孵育細胞5分鐘。
4. 用PBS清洗細胞三次。
5. 用1%牛血清白蛋白在PBS中孵育20分鐘。
6. 用PBS清洗細胞三次。
7. 在0.2μm濃度下用鬼筆環肽Alexa For 488孵育細胞20分鐘。
8. 用PBS清洗細胞三次。
9. 用DAPI（0.5μg/ml）孵育細胞10分鐘。
10. 用PBS清洗細胞三次。
11. 完全吸出通道并用ibidi封片劑重新填充。 現在樣品可在顯微鏡上觀察了。保存在陰暗陰涼處可儲存數周。
圖7：在 µ-Slide VI 0.4中的RAW-264.7用DAPI（細胞核、藍色）和Phalloidin, Alexa Fluor ® 488 Conjugate（肌動蛋白絲，綠色）
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