date:2022-08-16 15:39:10
小鼠 L929 成纖維細(xì)胞的多細(xì)胞球體是在µ-Slide 球體灌注中創(chuàng)建的。在從細(xì)胞懸浮液中形成球體后，使用 ibidi 泵系統(tǒng)進(jìn)行灌注。添加 ibidi Pump 可確保球體在長(zhǎng)期培養(yǎng)過程中獲得最佳營(yíng)養(yǎng)。
在灌注培養(yǎng) 1 周后，將球體固定并用鬼筆環(huán)肽染色以觀察 F-肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架。最后，球體被清除以增強(qiáng)成像深度和分辨率。我們使用EMOVI 方法進(jìn)行具有成本效益、無害的整體成像，這可以在固定球體上實(shí)現(xiàn)基于抗體的多重免疫標(biāo)記。球體的清除允許分析整個(gè)球體成纖維細(xì)胞甚至在球體成纖維細(xì)胞中心的成纖維細(xì)胞的分布和組織，同時(shí)保留球體的形態(tài)
01材料和試劑
細(xì)胞和試劑
•L929成纖維細(xì)胞（DSMZ，編號(hào)ACC 2）
•Accutase(A1110501,Gibco)
•細(xì)胞培養(yǎng)基 RPMI-1640 (Gibco, 21875034)
•胎牛血清 (FCS, Gibco, 10270106)
•細(xì)胞內(nèi) (IC) 固定緩沖液 (eBioscience, 00-8222-49)
•Dulbecco 磷酸鹽緩沖液（PBS、Sigma、D8537）
•正常小鼠血清（Jackson，015-000-120）
•正常驢血清（Jackson，AB_2337258）
•Triton X-100（Alfa Aesar，A16046）
•Flash Phalloidin™ Green 488（鬼筆環(huán)肽；500x，Thermo Fisher Scientific，46410）
•4'，6-二脒-2-苯基吲哚（DAPI，濃度20μg/mL，西格瑪奧德里奇，D9542）
•去離子水 (diH2O)
•異丙醇（Carl Roth，CP41.2）
•肉桂酸乙酯 (ECi) (Sigma, W243000)
02緩沖液和溶液
培養(yǎng)基
•新鮮制備并在 4°C下儲(chǔ)存長(zhǎng)達(dá)一周
•基礎(chǔ)培養(yǎng)基 RPMI-1640 (Gibco, 21875034)
•10% FCS （ Gibco，10270106）
封閉和染色緩沖液
•PBS
•1% （v/v）FCS
•1% (v/v) 正常小鼠血清
•1% (v/v) 正常山羊血清
•0.3% (v/v) Triton X-100
染色液
•封閉和染色緩沖液
•1:500 鬼筆環(huán)肽（最終濃度 1x）
•1:10 DAPI（最終濃度 2 µg/mL）
30% / 50% / 70% (v/v) 異丙醇稀釋液
•混合適當(dāng)體積的 diH2O 和異丙醇
•使用前預(yù)冷至 4 °C
03 設(shè)備
•ibidi 泵系統(tǒng) (ibidi, 10902)
•具有生物惰性表面鈍化的 ibidi µ-Slide 球體灌注（ibidi，80350）
•用于 µ-Slide 的 ibidi 串行連接器（ibidi，10830）
•ibidi 灌注套裝藍(lán)色 (ibidi, 10961)
•層流罩
•培養(yǎng)箱，37°C 和 5% CO2
•血細(xì)胞計(jì)數(shù)器（康寧)
•移液器(康寧）
•倒置共聚焦顯微鏡（Leica TCS SP8）
•徠卡應(yīng)用套件 X
•LIGHTNING（反卷積軟件）
•Imaris v9.5
04 操作程序
第一部分：µ-Slide球體灌注中的球體形成和培養(yǎng)
請(qǐng)?jiān)谑褂?µ-Slide Spheroid Perfusion 之前閱讀指示。所有步驟均需在無菌條件下執(zhí)行。
開始實(shí)驗(yàn)之前，在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)瓶（例如 T75）中制備 L929 成纖維細(xì)胞，細(xì)胞粘附在底部。細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天應(yīng)該是健康的并且最佳亞匯合。
重要提示：在 37°C 和 5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)過夜平衡所有必需的材料，例如載玻片、培養(yǎng)基和管道（灌注套件）。平衡對(duì)于防止氣泡隨著時(shí)間的推移而出現(xiàn)至關(guān)重要。
1. 將60 µl 無細(xì)胞培養(yǎng)基注入 µ-Slide Spheroid Perfusion 的每個(gè)通道（根據(jù)說明用提供的蓋玻片封閉）
2. 在培養(yǎng)箱中 37°C 孵育 2 小時(shí)。孵育期間始終關(guān)閉蓋子。
3. 用 Accutase 處理培養(yǎng)的 L929 細(xì)胞 1-2 分鐘以使其脫離。
4. 收集細(xì)胞懸液，離心，在培養(yǎng)基中稀釋；量取決于所需的細(xì)胞濃度。
5. 對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)并調(diào)整至終濃度為 5 x 105cells/ml。
6. 用無細(xì)胞培養(yǎng)基沖洗 µ-Slide 球體灌注的通道，以去除潛在的氣泡。
7. 將 45 µl 細(xì)胞懸液直接移入每個(gè)通道。
8. 在 37°C 下孵育 1 小時(shí)，使細(xì)胞在壁孔中沉淀。
9. 用60 µl 無細(xì)胞培養(yǎng)基填充 µ-Slide Spheroid Perfusion 的儲(chǔ)液庫(kù)。
10. 在 37°C 下孵育過夜以形成球體。
11. 檢查通道是否有氣泡。如果通道中存在任何氣泡，請(qǐng)用無細(xì)胞培養(yǎng)基小心沖洗通道。
12. 使用ibidi 串行連接器連接 µ-Slide Spheroid Perfusion 的 3 個(gè)通道
13. 根據(jù)ibidi 泵系統(tǒng)、流體單元和灌注裝置指示.
14. 將µ-Slide 球體灌注連接到 ibidi 泵系統(tǒng)并開始流動(dòng)。使用盡可能低的流速（5 mBar 氣壓導(dǎo)致流速為 0.74 ml/min）。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，直到球體具有所需的成熟狀態(tài)，在這種條件下培養(yǎng) 7 天后。
圖1：L929 成纖維細(xì)胞在孔中形成球體并在流動(dòng)條件下培養(yǎng)
圖 2：L929 成纖維細(xì)胞在µ-Slide 球體灌注中顯示球體形成。第1 天的示例
(A)第 6 天 (B)，使用 ibidi 泵系統(tǒng)灌注，0.74 毫升/分鐘。相差顯微鏡，10 倍物鏡，井徑 800 µm。
第二部分：L929 球體的染色和清除
染色直接在 µ-Slide Spheroid Perfusion 中進(jìn)行。在開始染色之前，請(qǐng)閱讀指示并遵循載玻片中關(guān)于一般移液和更換溶液的建議。
1. 當(dāng) L929 球體培養(yǎng)達(dá)到所需的成熟狀態(tài)（此處為 7 天后）時(shí)，小心地?cái)嚅_ µ-Slide球體灌注與 ibidi 泵系統(tǒng)的連接。
2. 在 RT 處用冷 IC 固定緩沖液固定球體 10 分鐘。
3. 在 RT 中將球體封閉和染色緩沖液中孵育 1 小時(shí)。
4. 在 37°C 下用染色溶液孵育球體過夜。從這一點(diǎn)開始，保持載玻片避光。圖 3A 顯示了清除前的球體成像。
5. 第二天，用 Blocking and Staining Buffer 清洗細(xì)胞一次。
6. 通過在冰上以上升 30%、50% 和 70% 的異丙醇稀釋液孵育15 分鐘，依次使球體脫水。
7. 在冰上用純異丙醇孵育球體兩次 15 分鐘。
8. 從冰中取出載玻片，讓它升溫至 RT。
9. 執(zhí)行清除：在 RT 處用純 ECi 灌注兩次。在這個(gè)階段，球體可以避光儲(chǔ)存數(shù)周，而不會(huì)顯著損失熒光。
10. 使用共聚焦顯微鏡的圖像球體（參見圖 3）。
圖 3：清除前后染色 L929 球體的共聚焦顯微鏡（紅色：鬼筆環(huán)肽，青色：DAPI）。
(A) 清除前的球體。請(qǐng)注意，由于光散射和吸收，只能看到外圍細(xì)胞，而看不到中心的細(xì)胞。(B, C) 清除后的球體。請(qǐng)注意，清洗前后的尺寸差異源于脫水和清洗過程，同一位置的橫截面。(B) 橫截面 (C) 體積/3D 視圖。球體的清除允許即使在球體成纖維細(xì)胞的中心也可以看到細(xì)胞，同時(shí)保留球體的形態(tài)。細(xì)胞核的計(jì)數(shù)甚至可以確定形成該球體的細(xì)胞數(shù)。
點(diǎn)擊請(qǐng)查看清除前后染色球體的直接對(duì)比視頻 (z-stack of 440 slices at a slice spacing of 0.36 µm)。
注：此實(shí)驗(yàn)方案來自ibidi的實(shí)際用戶，更多詳情可聯(lián)系本文作者E-mail address: selina.keppler@tum.de
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